Studi meccanici di singoli complessi ribosoma/mRNA

1.   Per rilevare l’antigene del virus dell’herpes simplex (HSV) è stato sviluppato un  saggio   enzimatico sensibile alla biotina e all’assorbimento della streptavidina (B / SA Capture ELISA). L’anti-HSV di coniglio (frazione di immunoglobulina G)   è stato rivestito su piastre di microtitolazione in polistirene   a 96 pozzetti irradiate a fondo     piatto e utilizzato per catturare l’antigene HSV.
2. Sono stati aggiunti campioni clinici da pazienti con herpes genitale. Come secondo anticorpo è stata utilizzata l’immunoglobulina G di coniglio anti-HSV G legata alla biotina. Il complesso antigene-anticorpo è stato rilevato   con streptavidina  coniugata con fosfatasi alcalina , che si era legata alla biotina.
3. Per i campioni clinici, il test aveva una sensibilità del 95,6% e una specificità del 91,4% rispetto al metodo di coltura tissutale. La presenza dell’antigene HSV in campioni non infettivi è stata confermata bloccando la reazione con anticorpi anti-HSV umani e di coniglio non marcati.
4. Il livello di antigene rilevato dal B/SA Capture ELISA non era necessariamente correlato al titolo di infettività dei campioni.
5. Gli antigeni dell’HSV potrebbero essere rilevati dall’ELISA di cattura B/SA quando l’infettività del virus è stata distrutta a 37 gradi C, dall’irradiazione UV o dal trattamento con Triton X-100, ma non dal trattamento con ipoclorito

È stata sviluppata una metodologia per ancorare i ribosomi di Escherichia coli 70S a una superficie di vetro reattiva alla cisteina modificata chimicamente.

I ribosomi immobilizzati mantengono la capacità di legare lo stampo dell’acido poliuridilico (poli (U)),  consentendo lo studio delle proprietà meccaniche dei singoli complessi ribosoma-poli (U) con l’uso di pinzette laser. Streptavidina  –  Microsfere di polistirene rivestite     legate specificamente all’estremità biotinilata di fili di poli (U) lunghi 3 ‘(fino a 10.000 basi).

È stato creato un nuovo metodo ottico per controllare la posizione della trappola laser lungo l’asse ottico del microscopio con una risoluzione di 2 nm, facilitando la misurazione della relazione forza-allungamento per poli (U). Alcuni complessi ribosoma-poli (U) immobilizzati supportavano una forza di 100 pN applicata all’estremità 3′ dell’mRNA.

 Il legame del Phe-tRNA (Phe) N-acetilato, un analogo dell’iniziatore fMet-tRNA (Met), ha rafforzato la popolazione di complessi in grado di resistere a forze elevate. La durata dell’omopolimero di poli (U) RNA, modellato come una catena simile a un verme, è risultata essere 0,79 +/- 0,05 nm e l’elasticità della spina dorsale è risultata essere 900 +/- 140 pN, simile ai valori per DNA a filamento singolo.